植酸酶是重要的飼料添加劑，來自大腸桿菌的植酸酶(EcAppA)為目前所知活性最高的植酸酶之一，具有重要的商業(yè)應(yīng)用價值，但是EcAppA的耐熱性較差，需要進(jìn)一步增強(qiáng)以避免在飼料制程中經(jīng)高溫處理而失去酶活。
中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所的郭瑞庭研究員帶領(lǐng)的研究組和東莞泛亞太生技公司及臺灣基酵生技公司合作，以植酸酶晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，對大腸桿菌植酸酶進(jìn)行理性設(shè)計(jì)以增加酶活及耐熱性。最近報(bào)導(dǎo)的兩個檸檬酸細(xì)菌 (Citrobacter): C. amalonaticus以及C. braakii植酸酶具有高活性以及高耐熱性，其氨基酸序列與EcAppA有高度相似性 (60及57 %)。研究人員將EcAppA與兩個Citrobacter植酸酶進(jìn)行序列分析，并對照EcAppA及其底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，比對出活性區(qū)附近Citrobacter植酸酶特有的氨基酸，然后將EcAppA上相對的位點(diǎn)進(jìn)行突變改造，結(jié)果發(fā)現(xiàn)V89T突變體的活性增加了17.5%。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型上分析發(fā)現(xiàn)，T89這個位點(diǎn)可能與鄰近的氨基酸形成氫鍵，進(jìn)而穩(wěn)定所在的loop區(qū)域結(jié)構(gòu)而增加酶活。此外，C. braakii植酸酶 (CbAppA) 和EcAppA分別具有五個和三個糖基化位點(diǎn)，針對這些糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有一個在底物結(jié)合域附近的糖基化位點(diǎn)是兩個酶共有的 (NVS204-206)，而其他的則不相同。NVS204-206 可能影響底物結(jié)合以及產(chǎn)物離去，所以他們進(jìn)行突變將之去除，發(fā)現(xiàn)酶活因此提高了9.6%。另一方面，研究人員把CbAppA特有的四個糖基化位點(diǎn)分別加到EcAppA上，其中三個單一位點(diǎn)的突變體在80oC的耐熱性從1.8%提升到5.6-9.5%，而同時帶有三個糖基化位點(diǎn)的突變體的耐熱性更大幅增加到27%，這些結(jié)果顯示，他們成功透過理性設(shè)計(jì)的手段將EcAppA改造得更為耐熱，活性更高。
研究成果已被Journal of Biotechnology 接收。該項(xiàng)目獲得“863”項(xiàng)目和“973”項(xiàng)目以及天津?qū)ｍ?xiàng)的支持。
