長(zhǎng)非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA），一般是指長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸，但是不具有編碼功能蛋白質(zhì)能力的長(zhǎng)鏈RNA分子。已有很多研究表明，lncRNAs廣泛參與一系列的基因表達(dá)調(diào)控和生物學(xué)過程。有意思的是，許多l(xiāng)ncRNAs所介導(dǎo)的調(diào)控是發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)的，因此需要新的工具來研究其在細(xì)胞核內(nèi)的功能。 

　　如同研究編碼基因一樣，lncRNA也需要通過質(zhì)粒載體將其在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行過表達(dá)來研究。然而，目前已知的真核表達(dá)載體多數(shù)是用來表達(dá)編碼基因的，載體上含有轉(zhuǎn)錄元件、翻譯元件和一些促進(jìn)核質(zhì)運(yùn)輸（細(xì)胞核和細(xì)胞漿運(yùn)輸）的元件。因此，這些載體上的轉(zhuǎn)錄本就會(huì)按照mRNA的加工方式進(jìn)行加工，并且運(yùn)到細(xì)胞漿里。使用這些載體外源表達(dá)一些僅定位在細(xì)胞核中的lncRNAs時(shí)，這些RNA經(jīng)常會(huì)被運(yùn)到胞漿里，從而阻礙了其功能的正常發(fā)揮，導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 

　　因此，針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，同時(shí)基于實(shí)驗(yàn)室近期發(fā)現(xiàn)的一類新型的lncRNA，sno-lncRNA（不含5’帽子和3’尾巴，兩端以snoRNA結(jié)尾，滯留在細(xì)胞核中，Yin et al., Mol Cell, 2012），研究人員設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種可以把外源的RNA滯留在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)載體，即snoVector。該載體是由pZW1載體（Wang et al., Cell 2014）改造而來。pZW1載體中的EGFP基因被一個(gè)含有多克隆位點(diǎn)的內(nèi)含子分成兩部分，只有當(dāng)內(nèi)含子被剪接下來后，才能形成成熟的egfp mRNA，并產(chǎn)生綠色熒光蛋白。研究組在pZW1載體序列多克隆位點(diǎn)中插入兩個(gè)snoRNA基因，并保留多個(gè)酶切位點(diǎn)，便于插入要表達(dá)的外源RNA（如圖）。當(dāng)該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，含有外源RNA序列的sno-lncRNA能夠被表達(dá)，通過觀察EGFP的產(chǎn)生可以監(jiān)測(cè)sno-lncRNA的加工。 

　　研究組以細(xì)胞核內(nèi)定位的lncRNA，如NEAT1、HOTAIR為研究對(duì)象，成功地提高了它們?cè)诩?xì)胞核的定位。重要的是，研究人員還證明以這種載體表達(dá)的兩端以snoRNA結(jié)尾的NEAT1可以模擬其內(nèi)源RNA的功能，并發(fā)揮生物學(xué)作用。研究還證明該snoVector載體可以很有效地表達(dá)幾乎任何長(zhǎng)度在3kb以內(nèi)的RNA，并使其滯留在細(xì)胞核內(nèi)。例如該載體可以將原本定位于胞漿中mRNAs，如SNRPN、CEBPA等表達(dá)并滯留在細(xì)胞核內(nèi)；一些通常被快速降解的內(nèi)含子序列也能被穩(wěn)定地表達(dá)并滯留在細(xì)胞核中；另外，該載體也可以用于表達(dá)miRNAs。此外，該載體能夠產(chǎn)生綠色熒光蛋白，并含有抗性基因，可以用于穩(wěn)定表達(dá)株的篩選。 

　　SnoVector用于過表達(dá)外源RNA并將其滯留在細(xì)胞核中，提供了一種新型的表達(dá)載體用于研究細(xì)胞核內(nèi)的lncRNAs。該載體的應(yīng)用將方便人們對(duì)細(xì)胞核內(nèi)RNA的功能和機(jī)制的研究，為lncRNA的研究提供新的研究手段。 

　　本課題在陳玲玲研究員指導(dǎo)下，主要由博士研究生殷慶飛和胡世斌完成，工作人員徐葉芬、中國科學(xué)院—馬普學(xué)會(huì)計(jì)算生物學(xué)伙伴研究所楊力研究員和美國康涅狄格大學(xué)Gordon Carmichael教授也參與了該工作。該研究得到了中科院、國家自然科學(xué)基金委、科技部和上海生科院的經(jīng)費(fèi)支持。 

在pZW1載體序列多克隆位點(diǎn)中插入兩個(gè)snoRNA基因，并保留多個(gè)酶切位點(diǎn)