普魯蘭酶是一種重要的工業(yè)用酶，可專一水解直鏈淀粉中的a-1,6-糖苷鍵，大量應(yīng)用于淀粉糖化生產(chǎn)過程中，在高直鏈淀粉、高葡萄糖漿、高麥芽糖漿和干啤酒等生產(chǎn)中也具有廣泛的應(yīng)用。 

　　中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所宋詼研究組從我國云南騰沖地區(qū)輪馬熱泉的淤泥中分離獲得了一株耐熱普魯蘭酶產(chǎn)生菌，普魯蘭糖水解分析結(jié)果確定該酶為I型普魯蘭酶。16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹分析的結(jié)果確定該菌為Anoxybacillus屬種，并從中克隆獲得了編碼上述耐熱普魯蘭酶的基因（Accession No. HQ844266），將該基因在大腸桿菌中進行了表達、純化及分析。酶學(xué)性質(zhì)分析的結(jié)果顯示，該酶的最適溫度為60℃，最適pH范圍5.6-6.4。同時，該酶具有良好的熱穩(wěn)定性，在60℃下處理48小時，仍可保持50%以上的活力；酶促反應(yīng)動力學(xué)分析顯示，在pH 5.8（NaAc-HAc buffer）、60℃，以普魯蘭糖為底物的條件下，該酶的Vmax和Km分別為750 U/mg和1.47 mg/ml，是目前文獻報道中比活力最高的耐熱普魯蘭酶。 

　　研究組還對該酶進行了晶體X-ray衍射分析，晶體結(jié)構(gòu)解析的結(jié)果顯示該酶具有淀粉酶13家族中典型的催化中心活性結(jié)構(gòu)域；并首次在同類酶中發(fā)現(xiàn)N端具有一個獨立的底物結(jié)合域，該結(jié)構(gòu)域的缺失導(dǎo)致比活力和底物結(jié)合力的降低，Vmax和Km分別為324 U/mg和1.95 mg/ml。在序列及晶體結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上，通過對該酶進行理性設(shè)計改造，得到了一系列穩(wěn)定性更好的突變體，其中突變體（T470A/Y175C/Delete(580-584)）的T50值比野生型提高了4℃，在65℃下的t1/2是野生型的4倍，能更好地滿足工業(yè)的應(yīng)用。 

　　同時，研究組將該普魯蘭酶編碼基因克隆到pBE980載體，在枯草芽孢桿菌中普魯蘭酶基因獲得了異源高效表達，通過培養(yǎng)基優(yōu)化，在優(yōu)化培養(yǎng)基（starch 37 g/L, peptone 15.5 g/L, CaCl2 1.5 g/L, KH2PO4 1 g/L, MgSO4 0.2 g/L, NaCl 2 g/L, FeSO4 0.05 g/L,(NH4)2SO4 1.5 g/L, pH 7.0）中搖瓶培養(yǎng)，胞外酶活可達350 U/mL。以上研究結(jié)果為普魯蘭酶制劑的國產(chǎn)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。 

　　研究成果發(fā)表于《生物工程學(xué)報》。