D-氨基酸不僅是生命體的組成成分（如組成細(xì)菌的細(xì)胞壁），而且是參與藥物和其他精細(xì)化工品合成的重要前體或模塊。美國G.I.A 公司的市場(chǎng)調(diào)研報(bào)告表明，未來D-氨基酸在藥物及藥物中間體合成中應(yīng)用、新藥研發(fā)以及一些新半合成抗生素合成中的需求量將大大增加，由此預(yù)測(cè)2017年D-氨基酸的全球市場(chǎng)量將達(dá)到37億美元。D-氨基酸的高效生物合成途徑之一是D-氨基酸脫氫酶催化酮酸的還原氨化一步生成D-氨基酸。D-氨基酸脫氫酶在細(xì)菌中一般以膜蛋白形式存在，不僅大大影響了其工業(yè)應(yīng)用，甚至有關(guān)研究都很少。D-氨基酸脫氫酶中研究的較多的是meso-二氨基庚二酸脫氫酶，以前報(bào)道的野生型該酶都只對(duì)meso-二氨基庚二酸（DAP）有活性。

　　中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員朱敦明帶領(lǐng)的生物催化反應(yīng)機(jī)理及應(yīng)用研究組通過基因挖礦的方法獲得了一個(gè)來源于Symbiobacterium thermophilum的meso-二氨基庚二酸脫氫酶。該酶除對(duì)meso-二氨基庚二酸有活性外，對(duì)D-丙氨酸、D-纈氨酸等也有活性，可以以丙酮酸、4-甲基-2-氧代戊酸等酮酸為底物分別生成D-丙氨酸和D-亮氨酸等D-氨基酸。其中該酶對(duì)丙酮酸的轉(zhuǎn)化率和ee值均高達(dá)99%。此酶是同家族已報(bào)道蛋白中第一個(gè)具有較寬底物譜的蛋白。此外，通過溫度穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，此酶是目前耐熱性最好的一個(gè)meso-二氨基庚二酸脫氫酶。這些特性使得該酶在D-丙氨酸合成以及通過蛋白質(zhì)工程獲取有效的D-氨基酸脫氫酶方面具有了優(yōu)越的價(jià)值。

　　為了研究該D-氨基酸脫氫酶的特殊催化性質(zhì)的分子基礎(chǔ)，研究組獲得了StDAPDH、與輔酶NADP結(jié)合以及同時(shí)與輔酶NADPH和底物DAP結(jié)合的晶體，并解析了它們的結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析表明在Met152的兩邊形成了兩個(gè)底物進(jìn)入通道，天然底物DAP通過其中一個(gè)較大的通道進(jìn)入而發(fā)生反應(yīng)；Met152處于另一底物通道的瓶頸，因而該通道只能通過較小的底物，如D-丙氨酸和丙酮酸。這與已知的該類酶的晶體結(jié)構(gòu)不同，從而揭示了StDAPDH具有特殊底物譜的分子機(jī)制，也為設(shè)計(jì)改造以拓展其催化性能及應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

　　StDAPDH的晶體結(jié)構(gòu)表明其底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域中在底物L(fēng)-手性中心周圍的氨基酸殘基是Phe146、Thr171、Arg181和His227，對(duì)這四個(gè)位點(diǎn)分別進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，以大位阻底物苯基丙酮酸為底物，對(duì)突變文庫進(jìn)行篩選后，得到了T171P、T171S、R181F、H227C、H227V五個(gè)活性明顯提高的突變子，其中H227V對(duì)苯基丙酮酸的比活為2.39 ± 0.06 U·mg-1，相對(duì)野生型提高了35.1倍，且所有突變體對(duì)D-Phe的ee值均大于99%。對(duì)所有突變體及野生型進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)參數(shù)的分析，發(fā)現(xiàn)突變的引入并沒有造成酶對(duì)底物親和力的改變，突變體活性的提高則是由酶催化效率提高導(dǎo)致的。對(duì)H227V和WT進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬表明，突變后底物Cα與NADP+的煙酰胺環(huán)上的C4'之間的原子距離由4.8 Å縮短到3.6 Å，與活性分析結(jié)果一致。結(jié)果表明，底物L(fēng)-手性中心周圍的氨基酸殘基的改變可以改變底物范圍和活性，而不影響反應(yīng)的立體選擇性。因此，通過對(duì)StDAPDH底物L(fēng)-手性中心周圍的氨基酸殘基進(jìn)行設(shè)計(jì)改造，可以獲得不同的氨基酸脫氫酶，合成不同的D-氨基酸，從而建立一個(gè)生物催化合成D-氨基酸的平臺(tái)技術(shù)。

　　研究成果已經(jīng)在Applied and Environmental Microbiology （2篇）和 ChemBioChem發(fā)表，其中ChemBioChem 文章被選為Inside Cover文章。該研究獲得國家自然科學(xué)基金（21072151）和973項(xiàng)目（2011CB710801）的支持。