在二代測(cè)序基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的RAD-seq技術(shù)是一項(xiàng)基于全基因組酶切位點(diǎn)的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)。由于特異性酶切位點(diǎn)在全基因組范圍內(nèi)廣泛分布，通過(guò)RAD-seq能夠在大多數(shù)物種內(nèi)獲得數(shù)萬(wàn)至數(shù)十萬(wàn)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)標(biāo)記。在此基礎(chǔ)上，RAD-seq技術(shù)又衍生出多種簡(jiǎn)化基因組測(cè)序方法，包含GBS，ddRAD，ezRAD以及2b-RAD等。其中，ddRAD-seq通過(guò)一個(gè)稀有酶與一個(gè)常見(jiàn)酶相結(jié)合對(duì)基因組DNA進(jìn)行雙酶切，免去隨機(jī)打斷的過(guò)程，是一種非常有前景的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)。不過(guò)，ddRAD技術(shù)雖然在建庫(kù)流程上比RAD做了一定程度的簡(jiǎn)化，但仍然包括12步，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)。因此，有必要對(duì)現(xiàn)有的ddRAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法進(jìn)行改進(jìn)，以克服其需要多次選酶、使用儀器復(fù)雜、成本偏高等缺陷，提高測(cè)序效率。
中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所博士研究生楊國(guó)騫在研究員郭振華與李德銖指導(dǎo)下，與中科院海洋研究所李莉研究組一起，開(kāi)發(fā)出一種被子植物中通用的雙酶切簡(jiǎn)化基因組（Modified ddRAD，簡(jiǎn)稱(chēng)MiddRAD）二代測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法。該方法首先發(fā)現(xiàn)一種被子植物通用酶切組合“AvaII + MspI”，減少了不同物種間需要多次選酶的步驟；其次，該方法將復(fù)雜的建庫(kù)專(zhuān)用儀器優(yōu)化為通用的分子生物學(xué)儀器；再次，該方法將P1測(cè)序接頭由37個(gè)堿基簡(jiǎn)化為25個(gè)堿基（barcode按5個(gè)堿基計(jì)算）并設(shè)計(jì)出一套新的barcode-adapter體系；最后，該方法還減少了純化酶切產(chǎn)物、連接前定量及混樣后純化連接產(chǎn)物的步驟，簡(jiǎn)化了建庫(kù)流程，允許僅使用50ng DNA即可完成文庫(kù)構(gòu)建。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單靈活、檢測(cè)成本低、檢測(cè)通量高，更易被科研人員掌握并能在通用分子實(shí)驗(yàn)室中實(shí)現(xiàn)，特別適用于需要對(duì)大量個(gè)體進(jìn)行SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)及分型的遺傳圖譜構(gòu)建、系統(tǒng)發(fā)育分析及群體遺傳學(xué)等研究。因此，MiddRAD-seq在農(nóng)業(yè)分子育種、進(jìn)化生物學(xué)和保護(hù)生物學(xué)等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用價(jià)值和推廣前景。
研究以Development of a universal and simplified ddRAD library preparation approach for SNP discovery and genotyping in angiosperm plants 為題發(fā)表于Plant Methods上。
該研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470322、31430011）的支持。
MiddRAD（a）與ddRAD（b）實(shí)驗(yàn)流程圖
